Algorytmy zastąpią Clauss? Nowe metody oznaczania fibrynogenu bez kalibracji

Czy algorytmy mogą zastąpić klasyczne metody oznaczania fibrynogenu?

Fibrynogen to kluczowe białko hemostazy – jego konwersja do fibryny stanowi końcowy etap kaskady krzepnięcia, prowadzący do powstania stabilnej sieci wzmacniającej czop płytkowy. W stanach masywnej utraty krwi – pourazowej, poporodowej czy śródoperacyjnej – stężenie fibrynogenu (norma: 2,0–4,0 g/L) może gwałtownie spadać do poziomów krytycznych. Wytyczne zalecają suplementację fibrynogenu, gdy występuje duże krwawienie lub wysokie ryzyko jego wystąpienia, co czyni szybki i precyzyjny pomiar tego parametru kluczowym elementem terapii.

Dostępne dziś metody – od złotego standardu Clauss po testy pochodzące z PT czy pomiary wiskoelastyczne – mają istotne ograniczenia. Test Clauss, choć niezawodny, wymaga kalibracji z użyciem osocza referencyjnego. Metody pochodzące z PT tracą dokładność przy niskich stężeniach (<2,0 g/L) i w obecności antykoagulantów. Systemy wiskoelastyczne (FIBTEM) dają wyniki w 5–10 minut, ale są semikwantytatywne i zawodne przy niedoborach innych czynników krzepnięcia.

Zespół z Erasmus MC przedstawił nowe podejście: modele matematyczne analizujące krzywe turbidimetryczne z testów generacji trombiny (TG), czasu protrombinowego (PT) i czasu reptilazy (RT), które przewidują stężenie fibrynogenu bez potrzeby kalibracji. W badaniu feasibility zweryfikowano te algorytmy na 44 próbkach klinicznych – w tym od pacjentów przyjmujących antykoagulanty, z wydłużonym INR i podwyższonym D-dimerem.

Jak działają modele matematyczne przewidujące fibrynogen?

Badanie objęło 44 próbki resztkowe osocza ubogopłytkowego od pacjentów poddanych rutynowym testom diagnostycznym w laboratorium hemostazy Erasmus MC (wrzesień–październik 2021). Kryterium włączenia stanowiło wykonanie oznaczenia fibrynogenu, anti-Xa, INR, D-dimeru lub testów koagulologicznych podczas stosowania DOAC. Zakres fibrynogenu w próbkach wynosił 1,1–16,6 g/L (próbka z 16,6 g/L została wykluczona jako wartość ekstremalna).

Opracowano trzy podejścia analityczne. Pierwszy model łączył dane z TG i turbidimetrii – symulowano polimeryzację fibryny na podstawie zmierzonego stężenia trombiny, generując krzywą referencyjną między wzrostem osłabienia światła a stężeniem fibrynogenu. Drugi model analizował krzywe PT: zastosowano regresję liniową i 3-warstwową sieć neuronową (NN) do ekstrakcji cech z krzywej turbidimetrycznej (minimalna przezroczystość, maksymalny gradient, pochodne drugiego rzędu). Trzeci model wykorzystywał krzywe RT z tą samą architekturą NN i regresją.

Wszystkie modele porównywano z wynikami metody Clauss jako referencją. Próbki podzielono na „standardowe” i „trudne” – te ostatnie obejmowały pacjentów z INR >1,1, D-dimerem >0,5 mg/L lub anti-Xa >0,1 U/mL. Obliczono współczynniki korelacji Pearsona dla każdej metody.

Model TG i turbidimetrii – jak radzi sobie z antykoagulantami?

Dla 43 próbek (zakres fibrynogenu: 1,1–8,7 g/L) model oparty na TG i turbidimetrii osiągnął korelację r=0,917 (p<0,001) z metodą Clauss. Jednak u 8 pacjentów uzyskano atypowe, bardzo niskie krzywe TG – problem dotyczył głównie osób z wysokimi poziomami anti-Xa (>1,0 U/mL; n=3), przyjmujących DOAC (n=1) lub z ekstremalnie wydłużonym INR >7 (n=1). Jeden pacjent przeszedł transplantację wątroby, co również mogło zaburzać generację trombiny.

Po wykluczeniu próbek z podwyższonym INR i anti-Xa korelacja wzrosła do r=0,965 (p<0,001). Zaobserwowano tendencję do niedoszacowania niskich poziomów fibrynogenu (<2,5 g/L), jednak ograniczona liczba takich próbek uniemożliwiła pełną weryfikację tego zjawiska. Autorzy podkreślają, że model uczenia maszynowego wymaga dalszego treningu na próbkach z ekstremalnymi wartościami fibrynogenu, aby poprawić precyzję w tych zakresach.

PT z turbidimetrią – czy rozwiązuje problemy klasycznych metod?

Analiza krzywych PT (wszystkie 43 próbki) wykazała korelację r=0,945 (p<0,001) dla modelu NN, r=0,944 (p<0,001) dla regresji wielozmiennej i r=0,965 (p<0,001) dla modelu łączonego. Po wykluczeniu próbek trudnych współczynniki wzrosły odpowiednio do r=0,973, r=0,984 i r=0,979.

Model NN wykazywał charakterystyczną krzywą S – przeszacowywał niskie i niedoszacowywał wysokie stężenia fibrynogenu, co jest znanym problemem komercyjnych testów opartych na PT. „Ten problem w kształcie krzywej S jest dobrze znanym ograniczeniem dostępnych komercyjnie testów fibrynogenu opartych na PT” – piszą autorzy. Zastosowanie regresji wielozmiennej rozwiązało tę kwestię – tylko jedna próbka (pacjent z INR 7,1) została niedoszacowana.

Istotną zaletą modelu opartego na PT jest możliwość precyzyjnej oceny wysokich stężeń fibrynogenu – do 9,0 g/L – bez konieczności rozcieńczania próbki, czego wymaga klasyczny test Clauss (górna granica: 5,0 g/L). Ograniczeniem pozostaje brak testów na próbkach od pacjentów z dysfibrinogenemią – wcześniejsze badania pokazały, że metody oparte na PT zawodzą w tej grupie.

Czas reptilazy – najdokładniejsza metoda algorytmiczna?

Testy RT przeprowadzono dla 42 z 43 próbek. Model NN osiągnął korelację r=0,960 (p<0,001), regresja wielozmiennej r=0,985 (p<0,001), a model łączony r=0,981 (p<0,001). Po wykluczeniu próbek trudnych wartości te wzrosły odpowiednio do r=0,970, r=0,989 i r=0,985.

Kluczową zaletą RT jest mechanizm działania – batroksybina rozszczepla bezpośrednio fibrynogen do fibryny (tylko fibrinopeptyd A), omijając kaskadę krzepnięcia. Dzięki temu test pozostaje niewrażliwy na obecność heparyny i innych czynników krzepnięcia. Tylko jeden pacjent – z ekstremalnie wydłużonym INR poza oknem terapeutycznym – uzyskał nieprawidłowy wynik we wszystkich modelach RT.

Regresja wielozmiennej i model łączony wykazały najwyższą dokładność w całym badaniu, z korelacjami przekraczającymi r=0,98 dla szerokiego zakresu stężeń fibrynogenu (1,1–8,7 g/L). To czyni metodę RT z analizą algorytmiczną najbardziej obiecującym kandydatem do dalszego rozwoju jako system point-of-care.

Czy to początek ery POC dla oznaczania fibrynogenu?

Wyniki badania stanowią potwierdzenie koncepcji algorytmicznego oznaczania fibrynogenu bez kalibracji referencyjnej. Najważniejsze zalety to: (1) brak potrzeby stosowania osocza kalibracyjnego, (2) dokładność porównywalna z metodą Clauss, (3) odporność na obecność antykoagulantów (zwłaszcza w przypadku RT), (4) możliwość pomiaru wysokich stężeń bez rozcieńczania próbki.

Kluczowym wyzwaniem pozostaje adaptacja metod do pracy z pełną krwią, a nie oczyszczonym osoczem – systemy POC muszą działać na próbkach whole blood. Autorzy sugerują rozwiązanie poprzez filtry komórkowe lub matematyczne korekty algorytmów. Niedawno wprowadzono ulepszoną metodę TG z całej krwi, co może ułatwić wdrożenie.

Dalsze badania muszą objąć: (1) próbki z bardzo niskimi stężeniami fibrynogenu (<2,0 g/L) – grupa krytyczna klinicznie, (2) pacjentów z dysfibrinogenemią – wcześniejsze dane pokazują, że metody PT zawodzą w tej populacji, (3) walidację na próbkach whole blood z różnorodnością etniczną pacjentów.

„Nasze modele matematyczne udowodniły, że dokładnie przewidują szeroki zakres stężeń fibrynogenu w próbkach rzeczywistych pacjentów z wykorzystaniem danych TG, PT i RT” – podsumowują autorzy. Obecnie opcje szybkich systemów POC do oznaczania fibrynogenu są ograniczone – to badanie otwiera drogę do ich rozwoju, co może znacząco poprawić opiekę nad pacjentami z masywnym krwawieniem w warunkach ostrego dyżuru, bloku operacyjnego czy izby przyjęć.

Co wyróżnia te modele na tle dostępnych metod?

Badanie feasibility z Erasmus MC wykazało, że algorytmy matematyczne analizujące krzywe turbidimetryczne z testów TG, PT i RT mogą przewidywać stężenie fibrynogenu z wysoką dokładnością (r=0,917–0,985) w porównaniu z metodą Clauss. Najlepsze wyniki uzyskano dla modelu opartego na czasie reptilazy z regresją wielozmienną (r=0,985), który pozostawał stabilny nawet u pacjentów z antykoagulacją. W przeciwieństwie do klasycznych metod, nowe algorytmy nie wymagają kalibracji z osoczem referencyjnym, co stanowi fundament dla przyszłych urządzeń point-of-care.

Kluczowe ograniczenia to: niewielka liczba próbek z ekstremalnymi wartościami fibrynogenu, brak walidacji u pacjentów z dysfibrinogenemią oraz konieczność adaptacji do pracy z pełną krwią zamiast osocza. Mimo to wyniki stanowią solidną podstawę do dalszego rozwoju technologii, która może zrewolucjonizować monitorowanie hemostazy u pacjentów krytycznych – szczególnie w urazach mnogich, krwawieniach poporodowych i dużych operacjach, gdzie każda minuta opóźnienia w ocenie fibrynogenu ma znaczenie kliniczne.

Autorzy podkreślają, że to dopiero pierwszy krok – przed wdrożeniem klinicznym konieczne są rozszerzone badania walidacyjne na większych grupach pacjentów, w tym prospektywna ocena wpływu na wyniki leczenia i bezpieczeństwo pacjentów. Jeśli dalsze etapy potwierdzą skuteczność, algorytmiczne oznaczanie fibrynogenu może stać się standardem w medycynie ratunkowej i intensywnej terapii.