Fibrinogen bydlęcy hamuje tworzenie włókien amyloidowych w chorobie Alzheimera

Jakie nowe strategie terapeutyczne odkrywają najnowsze badania?

Najnowsze badania rzucają nowe światło na potencjalne strategie terapeutyczne w chorobie Alzheimera, skupiając się na hamowaniu formowania włókien amyloidowych, które stanowią jeden z kluczowych elementów patogenezy tej choroby. Naukowcy zidentyfikowali fibrinogen bydlęcy (bFg) jako obiecującą molekułę hamującą agregację amyloidu β 1-42 (Aβ42) oraz redukującą jego cytotoksyczność, co może otworzyć nowe drogi w poszukiwaniu skutecznych terapii.

Choroba Alzheimera, będąca główną przyczyną demencji na świecie, dotyka miliony osób, a opracowanie skutecznych strategii terapeutycznych stanowi pilny globalny priorytet, szczególnie w kontekście starzejącej się populacji. Niedawno wprowadzony pierwszy lek terapeutyczny, Lecanemab, wykazał zdolność zapobiegania pogorszeniu funkcji poznawczych, jednak jego stosowanie ogranicza się do wczesnych etapów demencji lub łagodnych zaburzeń poznawczych (MCI), co podkreśla potrzebę opracowania dodatkowych opcji terapeutycznych.

Czy amyloidowe agregaty można powstrzymać?

Jedną z kluczowych strategii w zapobieganiu chorobie Alzheimera jest hamowanie tworzenia włókien amyloidowych Aβ42, które gromadzą się w mózgu, prowadząc do powstawania płytek starczych. Obecność tych płytek przyczynia się do rozwoju splątków neurofibrylarnych, w których włókna amyloidowe złożone z fosforylowanego białka tau gromadzą się w układzie nerwowym, ostatecznie prowadząc do dysfunkcji neuronów. Czy możliwe jest zablokowanie tego procesu na jego wczesnych etapach? Badania pokazują, że inhibitory blokujące przejście od form wczesnych, takich jak monomery i oligomery, do włókien amyloidowych mogą stanowić skuteczną strategię terapeutyczną. Przykładowo, wykazano, że kwas rozmarynowy hamuje tworzenie włókien amyloidowych Aβ42.

Oprócz tworzenia włókien, monomery i oligomery Aβ42 mogą również przyczyniać się do choroby Alzheimera poprzez wywieranie efektów cytotoksycznych. Na przykład, monomeryczny Aβ42 tworzy kanały w dwuwarstwie lipidowej, a oligomery Aβ42 indukują dysfunkcję synaptyczną poprzez uszkadzanie błon komórkowych. Molekuły wchodzące w interakcje z monomerami lub oligomerami Aβ42 mogą łagodzić te efekty. Przykładowo, kwas rozmarynowy zmniejsza cytotoksyczność poprzez wiązanie się z monomerami Aβ42.

W systemie proteostazy, białka opiekuńcze (chaperony molekularne) w cytozolu lub regionach pozakomórkowych naturalnie zapobiegają tworzeniu włókien amyloidowych i łagodzą toksyczność komórkową. Na przykład, białka szoku cieplnego (HSP) 70 i 90, które funkcjonują w cytozolu, hamują tworzenie włókien amyloidowych Aβ42. Klusteryna, obecna w płynach pozakomórkowych, hamuje tworzenie włókien amyloidowych Aβ42 poprzez interakcję z oligomerami i również zmniejsza toksyczność komórkową.

Czy fibrinogen może stać się nowym narzędziem terapeutycznym?

W nowym badaniu naukowcy skupili się na fibrinogenie – białku obecnym we krwi, które wykazuje aktywność podobną do białek opiekuńczych (chaperonów). Fibrinogen, białko odpowiedzialne za krzepnięcie krwi, powszechnie występujące w osoczu i zachowane u kręgowców, jest dobrze znanym białkiem o charakterze chaperonowym. Ma masę cząsteczkową około 340 kDa i pałeczkowatą strukturę składającą się z sześciu łańcuchów polipeptydowych (dwa łańcuchy Aα, dwa Bβ i dwa γ). Porównano dwa rodzaje fibrinogenu: bydlęcy (bFg) i ludzki (hFg), badając ich zdolność do hamowania tworzenia włókien amyloidowych Aβ42 oraz redukcji cytotoksyczności.

Wyniki badań wykazały, że bFg skutecznie hamuje tworzenie włókien amyloidowych Aβ42. Za pomocą różnorodnych metod, w tym testu dot blot, ultracentryfugacji analitycznej (AUC) i mikroskopii sił atomowych (AFM), udowodniono, że bFg wchodzi w interakcje zarówno z monomerami, jak i oligomerami Aβ42. Co szczególnie istotne, bFg całkowicie hamuje cytotoksyczność indukowaną przez Aβ42. “Nasze badania wykazały, że bFg może być obiecującym kandydatem do zapobiegania chorobie Alzheimera poprzez hamowanie zarówno tworzenia włókien amyloidowych, jak i cytotoksyczności indukowanej przez Aβ42” – piszą autorzy badania.

Jak eksperymentalne techniki ujawniają mechanizmy działania fibrinogenu?

W badaniu wykorzystano fluorescencyjną sondę Tioflawinę T (ThT), która wiąże się z rowkami łańcuchów bocznych włókien amyloidowych w sposób prostopadły do osi włókna. Monitorując intensywność fluorescencji ThT, badacze obserwowali przebieg czasowy tworzenia włókien amyloidowych Aβ42 o stężeniu 20 μM w temperaturze 37°C. W nieobecności fibrinogenu, intensywność ThT pozostawała niska przez pierwszą godzinę, kiedy to obserwowano cząstki ziarniste o średniej wysokości 5,0 ± 0,9 nm, identyfikowane jako oligomery. Po godzinie inkubacji intensywność ThT wzrosła, sugerując tworzenie włókien amyloidowych, co potwierdzono obrazami AFM uzyskanymi po 7 godzinach.

Interesujące jest porównanie z ludzkim fibrinogenem (hFg), który wykazuje wysokie podobieństwo strukturalne i umiarkowane podobieństwo sekwencji z bFg. Mimo tych podobieństw, hFg nie hamuje tworzenia włókien amyloidowych ani nie redukuje toksyczności komórkowej tak skutecznie jak bFg. Co więcej, hFg wchodzi w interakcje tylko z oligomerem Aβ42, a jego interakcja jest słabsza niż w przypadku bFg.

Czy zahamowanie ścieżek amyloidogenezy to klucz do leczenia?

Mechanizm molekularny leżący u podstaw tych różnic jest fascynujący. bFg wiąże się zarówno z monomerami, jak i oligomerami Aβ42, podczas gdy hFg oddziałuje tylko z oligomerami. Do oceny interakcji między Aβ42 a fibrinogenem na wczesnym etapie, przed tworzeniem włókien amyloidowych, wykorzystano test dot blot z dwoma przeciwciałami: 4G8, które rozpoznaje epitop w resztach 17-24 i oddziałuje z monomerami i oligomerami Aβ42, oraz A11, które specyficznie wykrywa oligomery Aβ42 poprzez rozpoznawanie unikalnych struktur oligomerycznych.

Wyniki testu dot blot pokazały, że w porównaniu z samym Aβ42, obecność bFg w stężeniu 3 μM spowodowała znaczne zmniejszenie intensywności plamki dla obu przeciwciał 4G8 i A11. Przy stężeniu bFg 0,3 μM, spadek zaobserwowano tylko dla A11, podczas gdy przy stężeniu bFg 0,03 μM, nie zaobserwowano znaczącego spadku dla żadnego z przeciwciał. Te odkrycia wskazują, że bFg oddziałuje zarówno z monomerami, jak i oligomerami Aβ42 przy stężeniu 3 μM, ale oddziałuje tylko z oligomerami przy stężeniu 0,3 μM. W przypadku hFg, przy stężeniu 3 μM, intensywność plamki zmniejszyła się dla A11, ale nie dla 4G8, co sugeruje, że hFg oddziałuje tylko z oligomerami Aβ42 przy stężeniu 3 μM, a ta interakcja jest słabsza niż w przypadku bFg.

Czy fibrinogen chroni komórki przed toksycznością Aβ42?

Równie ważne są implikacje dla hamowania cytotoksyczności. Zarówno monomery, jak i oligomery Aβ42 są znane z indukowania toksyczności komórkowej poprzez interakcję z błonami komórkowymi. Dlatego wiązanie bFg lub hFg z tymi formami jest kluczowe dla hamowania toksyczności. Cytotoksyczność Aβ42 w nieobecności i obecności bFg lub hFg oceniono za pomocą testu MTT. Aβ42 o stężeniu 20 μM, z lub bez cząsteczek fibrinogenu o stężeniu 3 μM, inkubowano w tych samych warunkach co w teście dot blot i AUC (1 godzina w 37°C) przed dodaniem do hodowli komórkowej. Żywotność komórek zmniejszyła się do około 60% po inkubacji z samym Aβ42. W obecności bFg, żywotność komórek powróciła do prawie 100%, podczas gdy hFg prowadził do tylko około 80% powrotu. Wyniki te wskazują, że bFg całkowicie hamuje cytotoksyczność indukowaną przez Aβ42, podczas gdy hFg tylko częściowo ją hamuje.

Istotnie, bFg w stężeniu 3 μM, który wiąże zarówno monomerami, jak i oligomerami Aβ42, całkowicie hamował toksyczność komórkową. Natomiast hFg w stężeniu 3 μM, który wiąże się tylko z oligomerami, wykazywał jedynie częściowe hamowanie toksyczności komórkowej. Wyniki te silnie wskazują, że zdolność bFg do wiązania zarówno monomerów, jak i oligomerów jest kluczowa dla hamowania toksyczności komórkowej.

Ile miejsc wiążących zapewnia skuteczne oddziaływanie bFg?

Na podstawie tych odkryć, badacze proponują model mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji między Aβ42 a cząsteczkami fibrinogenu. Zakładając, że oligomer to głównie 12-mer, jego efektywne stężenie wynosiłoby około 0,17 μM (obliczone jako 20 μM × 0,1/12, biorąc pod uwagę, że oligomery stanowią 10% całkowitego Aβ42 i składają się z 12 monomerów). Ponieważ bFg o stężeniu 3 μM oddziaływał z oligomerami Aβ42, a ta interakcja utrzymywała się przy stężeniu bFg 0,3 μM, co najmniej około dwa miejsca wiążące w bFg są wymagane do utrzymania interakcji przy stężeniu 0,3 μM. Ponieważ bFg składa się z dimerycznych podjednostek, jedno miejsce wiążące prawdopodobnie znajduje się na każdej podjednostce.

bFg oddziaływał również intensywnie z monomerami Aβ42 przy stężeniu 3 μM. Stężenie monomerów Aβ42 oszacowano na około 18 μM (obliczone jako 20 μM × 0,9, biorąc pod uwagę, że około 90% pozostało w formie monomerycznej). Na tej podstawie, co najmniej sześć miejsc wiążących byłoby wymaganych dla bFg do oddziaływania z monomerami Aβ42. W przeciwieństwie do tego, hFg nie oddziaływał z monomerami w badanym zakresie stężeń, co sugeruje znacznie mniejsze powinowactwo do monomerów niż bFg.

Jakie są różnice w wiązaniu Aβ42 przez bFg i hFg?

Na tym etapie konkretne miejsca wiążące dla Aβ42 na bFg i hFg pozostają nieznane. Jednak w literaturze sugerowano kilka potencjalnych miejsc. Wykazano, że Aβ42 oddziałuje z hFg w dwóch regionach: jednym zlokalizowanym między resztami aminokwasowymi 240 a 421 w łańcuchu Aα i drugim między resztami 366 a 414 w łańcuchu Bβ. Te miejsca mogą oddziaływać z oligomerami Aβ42. Biorąc pod uwagę, że bFg wykazuje homologię z hFg, odpowiednie miejsca w bFg mogą również służyć jako regiony wiążące dla oligomerów Aβ42. Jednak biorąc pod uwagę obecność sześciu miejsc wiążących bFg dla monomerów Aβ42, dodatkowe regiony wiążące muszą istnieć w bFg poza tymi zaangażowanymi w wiązanie oligomerów.

Identyczność sekwencji między bFg a hFg jest wysoka dla łańcuchów Bβ (82%) i γ (82%), ale stosunkowo niska dla łańcucha Aα (60%). Warto zauważyć, że region C-końcowy αC w łańcuchu Aα (reszty 221-610 łańcucha Aα w hFg i odpowiadający region w bFg) wykazuje znaczne różnice sekwencji między bFg a hFg (52% podobieństwo sekwencji). Region ten jest znany jako stosunkowo elastyczny i może angażować się w interakcje międzycząsteczkowe, aby ułatwić tworzenie skrzepu po trawieniu trombiną. Ta różnica sekwencji w regionie αC może przyczyniać się do różnych powinowactw wiązania bFg i hFg do Aβ42.

Jak wyniki badań przekładają się na kliniczną praktykę?

Jakie są implikacje kliniczne tych odkryć? Różne białka opiekuńcze, takie jak Hsp104, i białka podobne do opiekuńczych, takie jak α2-makroglobulina, haptoglobina i ludzka albumina surowicza, są znane z hamowania tworzenia włókien amyloidowych Aβ42. Jednak białka te celują głównie w formy pośrednie, takie jak oligomery lub protofibryle, a nie monomery. W przeciwieństwie do nich, bFg, który wiąże się zarówno z oligomerami, jak i monomerami Aβ42, ma potencjał do hamowania tworzenia włókien amyloidowych na wcześniejszych etapach niż te białka. Dlatego bFg stanowi obiecującego kandydata do terapii choroby Alzheimera.

Z drugiej strony, interakcja Aβ42 z hFg, jak wykazano, indukuje jego agregację, prowadząc do tworzenia bardziej stabilnych skrzepów fibrynowych poprzez reakcje zapośredniczone przez trombinę. Takie skrzepy są bardziej odporne na degradację zapośredniczoną przez plazminę, co może sprzyjać zapaleniu. Ponadto Aβ42 i fibryna współakumulują się w naczyniach mózgowych u pacjentów z chorobą Alzheimera, przyczyniając się do mózgowej angiopatii amyloidowej, chociaż Aβ40 jest dominującym izoformem. Biorąc pod uwagę, że bFg jest homologiem hFg, jego potencjał do podobnego tworzenia skrzepów wymaga starannego rozważenia w jego zastosowaniu terapeutycznym.

Pomimo tych obaw, bFg pozostaje obiecującym kandydatem do leczenia choroby Alzheimera. Jednym z możliwych podejść jest usunięcie bFg w odpowiednim czasie po wprowadzeniu go do mózgu, na przykład przy użyciu przeciwciał specyficznych dla bFg. Innym podejściem mogłoby być jednoczesne podawanie plazminy bydlęcej, aby zapobiec niepożądanemu tworzeniu się skrzepów z Aβ42. Konieczne są dalsze badania podstawowe i kliniczne, aby zbadać i zoptymalizować potencjał terapeutyczny bFg w chorobie Alzheimera.

Czy interakcje molekularne otwierają nowe perspektywy terapii?

Podsumowując, badania wykazały, że bFg hamuje tworzenie włókien amyloidowych poprzez wiązanie się zarówno z monomerem, jak i oligomerem Aβ42. W przeciwieństwie do tego, hFg, który wiąże się tylko z oligomerem, wykazywał słabszy efekt hamujący niż bFg. Ponadto bFg całkowicie hamował toksyczność komórkową Aβ42, podczas gdy hFg tylko częściowo ją hamował. Ustalenia te wskazują, że interakcja zarówno z monomerem, jak i oligomerem, które są obecne we wczesnym stadium poprzedzającym tworzenie włókien amyloidowych, jest niezbędna do skutecznego hamowania tworzenia włókien amyloidowych i toksyczności komórkowej indukowanej przez Aβ42.

Dlatego cząsteczki zdolne do wiązania zarówno monomeru, jak i oligomeru Aβ42 mogą stanowić obiecujących kandydatów terapeutycznych w chorobie Alzheimera. Badania in vitro mogą zatem pomóc w opracowaniu dalszych strategii terapeutycznych skupiających się na wczesnych formach molekularnych.

Podsumowanie

Najnowsze badania naukowe przedstawiają przełomowe odkrycia dotyczące potencjalnego wykorzystania fibrinogenu bydlęcego (bFg) w terapii choroby Alzheimera. W przeciwieństwie do ludzkiego fibrinogenu (hFg), bFg wykazuje wyjątkową zdolność do hamowania tworzenia włókien amyloidowych poprzez wiązanie się zarówno z monomerami, jak i oligomerami Aβ42. Co istotne, bFg w stężeniu 3 μM całkowicie hamuje cytotoksyczność indukowaną przez Aβ42, podczas gdy hFg osiąga jedynie częściową redukcję toksyczności. Badania wykazały, że bFg posiada co najmniej sześć miejsc wiążących dla monomerów Aβ42, co stanowi kluczową różnicę w porównaniu z hFg. Mimo obiecujących wyników, należy dokładnie rozważyć potencjalne ryzyko tworzenia się skrzepów, sugerując możliwość zastosowania dodatkowych strategii, takich jak użycie przeciwciał specyficznych dla bFg lub jednoczesne podawanie plazminy bydlęcej.