Fibrinogen w udarze: klucz do regeneracji mózgu i redukcji blizny

Udar mózgu jest jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności na świecie, a jego następstwem jest nie tylko bezpośrednie uszkodzenie tkanki nerwowej, ale także przewlekły proces powstawania włóknistej blizny. Ta patologiczna przebudowa macierzy pozakomórkowej (ECM), napędzana przez komórki stromalne, w tym periwaskularne fibroblasty (PVF), tworzy barierę dla regeneracji neuronów i przyczynia się do trwałych deficytów neurologicznych. Dotychczas mechanizmy inicjujące aktywację PVF pozostawały słabo poznane, co utrudniało opracowanie skutecznych terapii celowanych.

Nowe badanie przeprowadzone na mysim modelu fototrombotycznej niedokrwistości kortykalnej rzuca światło na kluczową rolę fibrinogenu – czynnika krzepnięcia krwi – w uruchamianiu kaskady prowadzącej do fibrozy. Naukowcy wykazali, że natychmiastowe osadzanie się fibrinogenu w przestrzeni okołonaczyniowej po uszkodzeniu naczyń mózgowych poprzedza aktywację PVF i ich migrację w kierunku ogniska uszkodzenia. Co więcej, farmakologiczna redukcja fibrinogenu znacząco zmniejsza powstawanie włóknistej blizny i poprawia regenerację neuronów. Wyniki te mogą otworzyć drogę do nowych strategii terapeutycznych w leczeniu udaru mózgu.

Jak zbadano rolę fibrinogenu w powstawaniu blizny po udarze?

Badanie przeprowadzono na transgenicznych myszach z reporterem fluorescencyjnym dla kolagenu typu I (Collagen1α1-EGFP), co umożliwiło precyzyjne śledzenie PVF w czasie rzeczywistym. Zastosowano model fototrombotycznej niedokrwistości (PT) – technikę indukującą udar kortykalny o kontrolowanej lokalizacji i wielkości. U myszy wykonano PT po wcześniejszym podaniu ancrodu – enzymu deplektującego fibrinogen – lub roztworu kontrolnego.

Zespół badawczy analizował zmiany morfologiczne i molekularne w PVF w kolejnych dniach po udarze (dzień 1, 3, 6 i 10). Wykorzystano zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej, rekonstrukcji 3D, immunohistochemię, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq), a także analizy interakcji ligand-receptor między różnymi populacjami komórek w miejscu uszkodzenia. Szczególną uwagę poświęcono obecności fibrinogenu w przestrzeni okołonaczyniowej oraz jego wpływowi na aktywację integryn β1 w PVF.

Aby zweryfikować udział komórek mieloidalnych indukowanych przez fibrinogen, wykorzystano myszy z mutacją uniemożliwiającą wiązanie fibrinogenu do receptora CD11b/CD18 (Fibγ390–396A) oraz farmakologiczną deplecję komórek mieloidalnych za pomocą inhibitora CSF1R (PLX5622).

W jaki sposób fibrinogen aktywuje periwaskularne fibroblasty?

Analiza sekwencyjna wykazała, że fibrinogen pojawia się masywnie w przestrzeni okołonaczyniowej już pierwszego dnia po udarze – znacznie wcześniej niż obserwuje się wzrost liczby GFP+ PVF (dzień 3 i 6). Immunofluorescencja i rekonstrukcje 3D potwierdziły, że fibrinogen kolokalizuje z PVF w przestrzeni okołonaczyniowej. Indywidualne PVF ulegały morfologicznej transformacji: zwiększała się ich objętość komórkowa (p<0,0001) oraz ekspresja białek ECM, takich jak kolagen I i periostyna, już w dniu 3 po PT.

Farmakologiczna deplecja fibrinogenu (ancrod) dramatycznie redukowała te zmiany. Liczba aktywowanych PVF w ognisku uszkodzenia spadła o około 65% (p<0,01), a ekspresja mRNA dla kolagenu I i periostyny w izolowanych PVF była znacząco niższa (p<0,05 i p<0,01). Na poziomie białkowym redukcja wynosiła około 62,5% dla kolagenu I i periostyny w dniu 3, oraz odpowiednio 57% i 78% w dniu 6 po PT (p<0,05).

Mechanizm działania fibrinogenu opiera się na aktywacji sygnalizacji integrynowej β1. Immunolabeling wykazał drastyczny wzrost aktywnej integryny β1 w PVF w dniu 3 po udarze – w czasie, gdy fibrinogen jest masywnie obecny. Blokada kinaz rodziny Src (SFK), kluczowych w przekazywaniu sygnału integrynowego, zmniejszyła indukowaną fibrinogenem ekspresję kolagenu I o około 60% w hodowli fibroblastów oponowych in vitro. Dodatkowo, fibrinogen regulował ekspresję CD44 – receptora powierzchniowego związanego z migracją fibroblastów – co sugeruje jego rolę nie tylko w aktywacji, ale także w inicjacji migracji PVF.

Czy fibrinogen reguluje migrację fibroblastów periwaskularnych?

Periwaskularne fibroblasty w warunkach fizjologicznych pozostają w przestrzeni okołonaczyniowej, pomiędzy warstwą komórek mięśniowych gładkich a stopkami astrocytarnymi. Po udarze, gdy pokrycie naczyń przez stopki astrocytów ulega rozpadowi (dzień 3 po PT), PVF inicjują jawną migrację w kierunku jądra uszkodzenia, gdzie budują włóknistą bliznę.

Deplecja fibrinogenu znacząco ograniczała ten proces. Liczba migrujących komórek GFP+ zmniejszyła się o około 55%, a średnia odległość migracji od naczyń krwionośnych spadła o około 30% w porównaniu do grupy kontrolnej (p<0,01 i p<0,001). Rekonstrukcje 3D wykazały, że w grupie kontrolnej liczne PVF migrowały na odległość przekraczającą 5 µm od najbliższego naczynia, podczas gdy w grupie z deplecją fibrinogenu takich komórek było znacznie mniej.

Ekspresja CD44, receptora dla składników ECM i czynnika migracji fibroblastów, była indukowana w PVF w dniu 3 po PT i regulowana przez fibrinogen in vitro. Co istotne, fibrinogen nie wpływał bezpośrednio na proliferację PVF w przestrzeni okołonaczyniowej w dniu 3 (brak różnic w liczbie komórek Ki67+), ale nieznacznie zwiększał ich apoptozę (około 4% w kontroli vs. 8% w grupie ancrod, p<0,05). Sugeruje to, że głównym efektem fibrinogenu jest modulacja aktywności komórkowej i migracji, a nie proliferacji.

Jaka jest rola komórek mieloidalnych w aktywacji PVF indukowanej fibrinogenem?

Fibrinogen jest znanym induktorem aktywacji komórek mieloidalnych, takich jak monocyty i makrofagi, poprzez wiązanie do receptora CD11b/CD18. Badanie wykazało, że w pierwszych dniach po udarze w przestrzeni okołonaczyniowej pojawiają się monocyty pochodzące z krwi (Ccr2+CD68⁻), makrofagi zapalne (Ccr2+CD68⁺) oraz aktywowane makrofagi periwaskularne (CD206+CD68⁺). Ich obecność koreluje z masywnym osadzaniem się fibrinogenu.

Aby zbadać udział komórek mieloidalnych w aktywacji PVF, zespół badawczy zastosował dwa podejścia: deplecję komórek mieloidalnych za pomocą inhibitora CSF1R (PLX5622) oraz wykorzystanie myszy Fibγ390–396A, u których fibrinogen nie może aktywować receptora CD11b/CD18. Deplecja komórek mieloidalnych zmniejszyła ekspresję periostyny o 47% (p<0,01) i nieistotnie statystycznie ekspresję kolagenu I o 30% w dniu 7 po PT. U myszy Fibγ390–396A ekspresja kolagenu I w PVF była obniżona o 45% (p<0,05), a periostyny – nieistotnie o 30% w dniu 3 po PT.

Analiza scRNA-seq wykazała, że deplecja fibrinogenu drastycznie zmienia wzorzec interakcji komórkowych. W grupie kontrolnej najsilniejsze interakcje zachodziły między PVF a makrofagami zapalnymi, z udziałem szlaków sygnalizacyjnych EGFR, SDC2 i receptorów integrynowych – znanych regulatorów proliferacji i aktywacji fibroblastów. Po deplecji fibrinogenu interakcje PVF-makrofagi zapalne były znacznie osłabione, natomiast wzrosły interakcje PVF-monocyty. Sugeruje to, że fibrinogen nie tylko bezpośrednio aktywuje PVF, ale także moduluje ich mikrośrodowisko poprzez wpływ na komórki mieloidalne.

Jak fibrinogen wpływa na interakcje PVF z astrocytami i regenerację neuronów?

Astrocyty tworzące granicę uszkodzenia są kluczowe dla ograniczenia rozprzestrzeniania się uszkodzenia, ale jednocześnie mogą hamować regenerację aksonów. Badanie wykazało, że PVF wydzielają kolagen I, który indukuje aktywację astrocytów i tworzenie granicy uszkodzenia poprzez receptor CD44.

Analiza interakcji ligand-receptor ujawniła, że w grupie kontrolnej najsilniejsze sygnały między PVF a astrocytami obejmowały ligandy takie jak ADAM12, ANGPTL4, MDK, TIMP1 oraz różne szlaki sygnalizacyjne kolagenu. Deplecja fibrinogenu drastycznie redukowała te interakcje. Immunofluorescencja potwierdziła, że w grupie ancrod depozycja kolagenu I kontaktującego się z astrocytami GFAP+ na granicy uszkodzenia była obniżona o około 50% w dniu 10 po PT (p<0,0001). Ekspresja CD44 przez astrocyty GFAP+ również była znacząco zmniejszona (p<0,0001), a kolokalizacja PVF-kolagen I z astrocytami CD44+ była prawie całkowicie zniesiona.

Co istotne, deplecja fibrinogenu poprawiła przeżywalność neuronów i regenerację aksonów. Liczba komórek NeuN+ w penumbrze kortykalnej wzrosła o około 100% w porównaniu do kontroli. Immunolabeling dla 5-hydroksytryptaminy (5-HT) – markera włókien serotoninergicznych – wykazał, że w grupie ancrod długość aksonów wzrosła o około 55%, a liczba aksonów przekraczających granicę uszkodzenia zwiększyła się o około 230% (p<0,05). Te dane sugerują, że redukcja fibrinogenu nie tylko ogranicza fibrozę, ale także poprawia środowisko dla regeneracji neuronalnej.

Co te wyniki oznaczają dla przyszłych strategii terapeutycznych w udarze?

Badanie proponuje nowy model patogenezy włóknistej blizny po udarze mózgu. Fibrinogen, depozytujący się natychmiast po uszkodzeniu naczyń, działa jako wczesny regulator aktywacji PVF poprzez sygnalizację integrynową β1 i kinazy Src. Indukuje on także aktywację komórek mieloidalnych, w tym makrofagów periwaskularnych, które dodatkowo wspierają aktywację PVF. Wydzielany przez PVF kolagen I stymuluje astrocyty do tworzenia granicy uszkodzenia, co hamuje regenerację aksonów.

Farmakologiczna deplecja fibrinogenu (np. ancrod) lub modulacja jego wiązania do receptorów integrynowych może stanowić nową strategię terapeutyczną. Zmniejszenie poziomu fibrinogenu nie tylko ogranicza powstawanie włóknistej blizny, ale także poprawia środowisko dla regeneracji neuronów – zwiększa przeżywalność komórek NeuN+ i regenerację aksonów serotoninergicznych. Co ważne, te efekty osiągnięto bez istotnego wpływu na wielkość ogniska niedokrwiennego, co sugeruje, że interwencja celuje w procesy naprawcze, a nie w ostrą fazę uszkodzenia.

Autorzy badania podkreślają jednak pewne ograniczenia. Model fototrombotyczny różni się od ludzkiego udaru pod względem mechanizmu uszkodzenia naczyń i rozmiaru ogniska. Ponadto, ancrod może wywoływać krwawienia, co wymaga ostrożności w zastosowaniu klinicznym. W przyszłości konieczne będą badania nad bardziej precyzyjnymi metodami modulacji sygnalizacji fibrinogen-integryna, np. poprzez blokowanie specyficznych domen fibrinogenu lub inhibitory kinaz Src.

Interesujące jest również, że autorzy zaobserwowali redukcję ekspresji kolagenu I w modelu zwyrodnienia plamki żółtej (CNV) po deplecji fibrinogenu, co sugeruje, że mechanizm fibrinogen-PVF może mieć zastosowanie w innych chorobach OUN, takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera czy urazy mózgu.

Jakie są najważniejsze wnioski z tego badania?

Badanie dostarcza pierwszych dowodów na to, że fibrinogen działa jako wczesny regulator aktywacji periwaskularnych fibroblastów po udarze mózgu. Jego depozycja w przestrzeni okołonaczyniowej uruchamia kaskadę sygnalizacyjną poprzez integryny β1, prowadząc do aktywacji PVF, ich migracji i wydzielania kolagenu I. Fibrinogen moduluje również interakcje PVF z komórkami mieloidalnymi i astrocytami, kształtując środowisko hamujące regenerację neuronalną. Farmakologiczna deplecja fibrinogenu znacząco zmniejsza powstawanie włóknistej blizny, poprawia przeżywalność neuronów i regenerację aksonów. Wyniki te otwierają drogę do opracowania nowych strategii terapeutycznych celujących w modulację fibrinogenu lub jego receptorów integrynowych, co może poprawić wyniki leczenia pacjentów po udarze mózgu. Kluczowe będzie jednak dalsze badanie nad bezpieczeństwem i skutecznością tych interwencji w warunkach klinicznych, a także identyfikacja optymalnych okien czasowych i dawek terapeutycznych. Odkrycie mechanizmu fibrinogen-PVF może mieć szersze implikacje dla innych chorób OUN związanych z fibrozą i uszkodzeniem naczyń.