Czy modyfikacje fibrinogenu przez węglowodany mogą wskazać ryzyko CVD?
Modyfikacje fibrinogenu przez węglowodany: nowe spojrzenie na ocenę ryzyka sercowo-naczyniowego
Glikozylacja i glikacja to dwa rodzaje modyfikacji białek przez węglowodany, które – mimo podobieństw – zasadniczo różnią się mechanizmami molekularnymi i znaczeniem w procesach fizjologicznych i patologicznych. Glikozylacja jest procesem enzymatycznym, ściśle regulowanym i zintegrowanym z biosyntezą białek, podczas gdy glikacja zachodzi w sposób nieenzymatyczny, przypadkowy, najczęściej w warunkach hiperglikemii, zarówno w środowisku zewnątrz-, jak i wewnątrzkomórkowym. W ostatnich latach rośnie zainteresowanie modyfikacjami węglowodanowymi białek jako potencjalnymi biomarkerami ryzyka sercowo-naczyniowego.
Fibrinogen, kluczowe białko w procesie krzepnięcia krwi, jest rozpuszczalną makromolekułą, która pod wpływem trombiny przekształca się w nierozpuszczalny skrzep fibrynowy. Modyfikacje potranslacyjne fibrinogenu, w tym glikozylacja i glikacja, mogą znacząco wpływać na proces tworzenia skrzepu, jego stabilność i oporność na degradację, zwiększając fenotyp protrombotyczny. “Nasze badania wyraźnie pokazują, że zarówno glikozylacja, jak i glikacja fibrinogenu mogą prowadzić do istotnych zmian w strukturze skrzepu i jego właściwościach fizykochemicznych” – podkreślają autorzy przeglądu.
Fibrinogen jest złożonym glikoproteinowym heksamerem o masie cząsteczkowej 340 kDa, składającym się z dwóch kopii trzech różnych łańcuchów polipeptydowych (2Aα, 2Bβ i 2γ), połączonych 29 mostkami disiarczkowymi. Strukturalnie cząsteczka fibrinogenu ma około 45 nm długości, z domenami globularnymi na każdym końcu, połączonymi w środku przez α-helikalne spirale. Masy cząsteczkowe łańcuchów Aα, Bβ i γ wynoszą odpowiednio 66,5, 52 i 46,5 kDa. Potranslacyjne dodanie związanego z asparaginą węglowodanu do łańcuchów Bβ i γ podnosi całkowitą masę cząsteczkową do około 340 kDa.
Synteza fibrinogenu odbywa się głównie w hepatocytach, gdzie mRNA fibrinogenu jest poddawane splicingowi i translacji na łańcuchy polipeptydowe. Następnie łańcuchy te przechodzą modyfikacje potranslacyjne, w tym przyłączanie jednostek oligosacharydowych poprzez wiązania N-glikozydowe. Ta glikozylacja jest niezbędna dla prawidłowej polimeryzacji fibryny i architektury skrzepu. Montaż fibrinogenu zachodzi w procesie stopniowym: początkowe tworzenie kompleksów Aα-γ i Bβ-γ, następnie ich połączenie w półcząsteczki Aα/Bβ/γ, i ostatecznie w kompletną formę heksameryczną (Aα/Bβ/γ)₂. Wszystkie sześć regionów N-terminalnych zbiega się w centralnej domenie E cząsteczki, podczas gdy C-końce łańcuchów Bβ i γ rozciągają się na zewnątrz do dystalnych domen D.
Fibrinogen jest kodowany przez trzy ściśle powiązane geny (FGA, FGB i FGG), każdy określający strukturę pierwszorzędową jednego z jego trzech łańcuchów polipeptydowych, odpowiednio Aα, Bβ i γ. Mechanizmy regulujące ekspresję genów fibrinogenu są nadal w dużej mierze nieustalone. Te geny są zgrupowane na chromosomie 4 i tłumaczą się na powstające polipeptydy pre-pro-łańcucha. Co ciekawe, nadekspresja któregokolwiek z tych genów wydaje się regulować w górę ekspresję innych, sugerując skoordynowaną regulację.
Kluczowe fakty o modyfikacjach fibrinogenu:
- Glikozylacja jest procesem enzymatycznym i regulowanym, podczas gdy glikacja zachodzi nieenzymatycznie w warunkach hiperglikemii
- Modyfikacje węglowodanowe fibrinogenu wpływają na:
– strukturę i stabilność skrzepu
– proces krzepnięcia krwi
– podatność na fibrynolizę - Zmiany w profilach glikozylacji fibrinogenu występują w:
– chorobach wątroby
– migotaniu przedsionków
– cukrzycy
– niewydolności nerek
Jak glikozylacja i glikacja wpływają na strukturę i funkcję fibrinogenu?
Profil N-glikozylacji ludzkiego fibrinogenu został opisany przez Adamczyk i wsp., którzy zidentyfikowali dwuantenowe digalaktozylowane monosjalizowane (A2G2S1) i disjalizowane (A2G2S2) glikany jako najczęstsze formy, stanowiące odpowiednio około 53,0% i 32,6% N-glikanów fibrinogenu. Zwykle łańcuch α fibrinogenu nie jest N-glikozylowany, mimo że ma dwa potencjalne miejsca N-glikozylacji w Asn453 i Asn686. Co ciekawe, deglikozylacja fibrinogenu przyspiesza szybkość polimeryzacji i zwiększa lateralną agregację włókien fibryny. Konstytutywna glikozylacja wpływa na zachowanie fibrinogenu, wywierając siłę odpychającą, która utrzymuje rozpuszczalność i ogranicza tworzenie fibryny, wpływając tym samym na architekturę skrzepu.
Istnieje kilka mutacji, które wprowadzają nowe sekwencje konsensusu glikozylacji, skutkując dodatkową masą cząsteczkową i zmienionym ładunkiem białka. Lokalizacja dodatkowych oligosacharydów w niektórych nieprawidłowych wariantach fibrinogenu może dostarczyć wglądu w ich wpływ na polimeryzację fibryny. Opisano mutacje z nabyciem glikozylacji na łańcuchu Aα, Aα Arg141 do Ser (fibrinogen Lima) i Aα Ser434 do Asn, które tworzą nowe miejsca N-glikozylacji. Fibrinogen Lima jest nieprawidłowym fibrinogenem z dodatkową N-glikozylacją w Aα Asn139, co wydaje się odpowiedzialne za upośledzenie polimeryzacji fibryny. Badanie właściwości skrzepu w formach homozygotycznych i heterozygotycznych wykazało, że skrzepy homozygotyczne składają się z cieńszych włókien o zmniejszonej przepuszczalności i zmienionych właściwościach reologicznych.
Warianty w genach fibrinogenu są bezpośrednio związane z dziedzicznymi zaburzeniami fibrinogenu i można je sklasyfikować jako anomalie ilościowe i jakościowe. Wrodzone zaburzenia fibrinogenu (CFDs) obejmują dysfibrinogenemię, charakteryzującą się normalnymi krążącymi poziomami fibrinogenu z nieprawidłową funkcją, oraz hipofibrinogenemię/afibrinogenemię, które charakteryzują się zmniejszonymi (<1,5 g L-1) lub nieobecnymi poziomami fibrinogenu we krwi. Połączenie niskiego stężenia i dysfunkcyjnego fibrinogenu definiuje się jako hipodysfibrinogenemię. Dysfibrinogenemia i hipodysfibrinogenemia są typowo zaburzeniami autosomalnie dominującymi spowodowanymi heterozygotyczną mutacją (rzadko homozygotyczną) lub złożoną heterozygotyczną mutacją w jednym z genów fibrinogenu.
Dysfibrinogenemia związana z chorobą wątroby charakteryzuje się zwiększoną zawartością kwasu sialowego, co bezpośrednio koreluje z wydłużonym czasem trombinowym. Usunięcie nadmiaru kwasu sialowego przywraca normalny czas trombinowy i polimeryzację monomeru fibryny. Marskość wątroby, główny czynnik ryzyka zaburzeń hemostazy, często prowadzi do krwawień lub zakrzepicy. Badanie Gligorijević i wsp. analizowało wzór glikozylacji fibrinogenu za pomocą mikromacierzy białkowej opartej na lektynach, wraz z wzorcem karbonylacji poszczególnych łańcuchów fibrinogenu u pacjentów z marskością wątroby. Wyniki wskazywały na typowy wzrost kilku fragmentów węglowodanowych (Galβ-1,4GlcNAc, terminalny α-2,3 Sia i α1,3 Man), zmniejszenie rdzeniowej fukozylacji fibrinogenu i wyższą podatność łańcucha Aα na karbonylację.
Czy profile glikanów otwierają nowe perspektywy diagnostyczne?
W 2010 roku Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne (AHA) wprowadziło model Life’s Simple 7, definiujący zdrowie sercowo-naczyniowe, obejmujący siedem wskaźników: cztery zachowania zdrowotne (dieta, aktywność fizyczna, palenie, BMI) i trzy czynniki kliniczne (cholesterol, ciśnienie krwi, glukoza we krwi). Mimo ogólnego spadku skorygowanych wiekowo wskaźników śmiertelności z powodu chorób sercowo-naczyniowych (CVD), bezwzględna liczba zgonów z powodu CVD nadal rośnie. Globalnie CVD pozostaje główną przyczyną śmierci, odpowiadając za około 18 milionów zgonów w 2017 roku, co podkreśla pilną potrzebę biomarkerów wczesnego wykrywania.
W ostatnich latach rośnie zainteresowanie charakterystyką profilu glikozylacji fibrinogenu i jego znaczeniem jako biomarkera w różnych chorobach. Zarówno polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP), jak i modyfikacje potranslacyjne są związane z poziomami fibrinogenu, zachowaniem podczas krzepnięcia i ryzykiem sercowo-naczyniowym. Czy zmiany w profilu glikozylacji fibrinogenu mogą być wykorzystane jako wczesny marker ryzyka sercowo-naczyniowego? Jakie implikacje kliniczne niesie ze sobą wykrywanie takich modyfikacji?
Potencjał glikanów jako biomarkerów w CVD wynika z systemowej odpowiedzi prozapalnej, która wyzwala wątrobowe uwalnianie białek ostrej fazy, w tym fibrinogenu, białka C-reaktywnego (CRP), haptoglobiny, surowiczego amyloidu A (SAA), które są głównie glikoproteinami z wiązaniem N. W miarę postępu stanu zapalnego wzory N-glikozylacji stają się bardziej złożone poprzez rozszerzenia reszt, zwiększone rozgałęzienie lub utratę kwasu sialowego/galaktozy.
Zmiany w wzorach N-glikozylacji immunoglobuliny G (IgG) wyłoniły się jako obiecujące predyktory zdarzeń CVD. W dwóch zagnieżdżonych badaniach case-control, sześć odrębnych struktur N-glikanów IgG było znacząco związanych z incydentem CVD. Menni i wsp. dodatkowo zidentyfikowali cztery cechy glikanu IgG związane z tworzeniem blaszki szyjnej, niezależnie od konwencjonalnych czynników ryzyka.
Znaczenie kliniczne modyfikacji fibrinogenu:
- Potencjał jako biomarker wczesnego ryzyka sercowo-naczyniowego
- Glikowany fibrinogen tworzy gęstsze i trudniejsze do rozpuszczenia skrzepy
- Modyfikacje mogą prowadzić do:
– stanu protrombotycznego
– zaburzeń krzepnięcia
– zwiększonego ryzyka powikłań naczyniowych - Kontrola glikemii może zmniejszać niekorzystne modyfikacje fibrinogenu
Jak modyfikacje węglowodanowe wiążą się z chorobami metabolicznymi i zakaźnymi?
Glikany i regulatory sjalilacji wyłaniają się jako potencjalne biomarkery i cele terapeutyczne dla miażdżycy, ze względu na ich obfitą obecność na śródbłonku naczyniowym i na krążących lipoproteinach zaangażowanych w tworzenie blaszki. Sjalilacja odgrywa kluczową rolę w regulacji miażdżycy. Desjalilacja LDL przez ludzkie neuraminidazy reprezentuje nowy szlak proaterogenny. ST6GAL1-mediowana sjalilacja reguluje cząsteczki adhezyjne i receptory chemokinowe, wpływając na rekrutację monocytów we wczesnej aterogenezie.
Produkty glikacji (AGEs) i glikozylacji przyczyniają się do przebudowy sercowo-naczyniowej w zaburzeniach metabolicznych, takich jak otyłość, cukrzyca i zespół metaboliczny, poprzez bezpośrednie efekty (podwyższone AGEs, ROS, zapalenie) i pośrednie mechanizmy poprzez choroby współistniejące, w tym miażdżycę, zawał serca, niewydolność serca i migotanie przedsionków (AF). Krążące i tkankowe AGEs korelowały z nierównowagą metaboliczną i przewlekłą progresją CVD, zarówno dietetyczne, jak i endogenne AGEs działają jako czynniki ryzyka kardiometabolicznego. AGEs promują dysfunkcję śródbłonka i sztywnienie naczyń, i były związane ze sztywnością tętnic niezależnie od glikemii.
Niedawne badanie oceniło potencjał diagnostyczny profili N-glikanu fibrinogenu u pacjentów z migotaniem przedsionków (AF) poddawanych ablacji cewnikowej. Trzy glikopeptydowe o niskiej zawartości z łańcucha γ były znacząco zmniejszone u pacjentów z AF w porównaniu z grupą kontrolną. Wzrost form asjalowanych może leżeć u podstaw stanu protrombotycznego obserwowanego w AF. Wiązanie wapnia w miejscach kwasu sialowego o niskim powinowactwie na fibrinogenie może ułatwiać polimeryzację, podczas gdy miejsca Ca2+ o wysokim powinowactwie w domenie D wpływają na trzeciorzędową strukturę fibryny.
Czy zmiany w glikozylacji fibrinogenu mogą przewidywać powikłania w cukrzycy i niewydolności nerek?
Glikozylowany fibrinogen ma szczególne znaczenie w patogenezie cukrzycy. Główne wyniki badania Daugaard i wsp. wykazały, że całkowity fibrinogen i bezwzględne poziomy fibrinogenu αE, fibrinogenu γ’ i sjalilowanego fibrinogenu były wyższe na początku u pacjentów z cukrzycą, którzy później doświadczyli udarów. Podobne wyniki zaobserwowano u pacjentów otyłych, podczas gdy po operacji bariatrycznej poziomy sjalilowanego fibrinogenu były niższe.
Wysokie ryzyko powikłań sercowo-naczyniowych obserwowano u pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek (ESRD), co jest przynajmniej częściowo związane z opóźnionym tworzeniem skrzepu, zwiększoną siłą skrzepu i opóźnioną lizą skrzepu. Dwa niedawne badania Baralić i wsp. miały na celu zbadanie glikozylacji fibrinogenu u pacjentów z ESRD. Wyniki z pierwszego badania sugerują, że glikan fibrinogenu A2BG2 wzrasta, podczas gdy FA2 maleje. Zmiany te były najbardziej widoczne w łańcuchu γ, a fukozylacja była silnie związana z uszkodzeniem błony otrzewnowej u pacjentów na dializie otrzewnowej. Badanie follow-up sugerowało, że bogate w mannozę glikany na fibrinogenie mogą przewidywać śmiertelność z wszystkich przyczyn i śmiertelność sercowo-naczyniową u pacjentów z ESRD.
Wpływ starzenia na zawartość węglowodanów fibrinogenu również zbadano, izolując fibrinogen z próbek osocza zdrowych osób w wieku od 21 do 83 lat. Analiza mikromacierzy lektynowych wykazała zwiększoną glikozylację fibrinogenu z powodu starzenia, z przewagą zwiększenia N-glikanów typu wysokomannozowego lub hybrydowego, a także tri-/tetraantenowych złożonych N-glikanów z większą zawartością galaktozy i reszt N-acetyloglukozaminy. Zmiany glikozylacji fibrinogenu w zdrowym starzeniu najprawdopodobniej wpływają na strukturę skrzepu, skutkując gęściej upakowaną siecią, i funkcję, mianowicie czas krzepnięcia.
Palomino i wsp. niedawno porównali fibrinogen płodowy i dorosły, identyfikując 39 glikanów w fibrinogenie płodowym oraz zwiększoną glikozylację i sjalilację, szczególnie w łańcuchu Bβ, wspierając wcześniejsze ustalenia, że interakcje ‘B’ są bardziej widoczne w tworzeniu fibryny płodowej.
Jak przebiega nieenzymatyczna glikacja fibrinogenu i jakie są jej konsekwencje?
Oligosacharydy O-związane fibrinogenu są mniej dobrze opisane. Pierwsze wskazania na O-glikozylację fibrinogenu ssaków pochodzą z raportu używającego fibrinogenu w badaniach wiązania lektyny. Niedawne dowody na O-glikozylację ludzkiego fibrinogenu pochodzą z porównawczej analizy metabolomicznej moczu od pacjentów cierpiących na zakażenie dróg moczowych (UTI) w porównaniu z kontrolami. Zwiększone uwalnianie fragmentów fibrinogenu w moczu jest odpowiedzią na infekcję lub uszkodzenie nerek związane z infekcją.
Glikacja jest nieenzymatyczną reakcją, która rozpoczyna się od interakcji między cukrami redukującymi lub ich produktami autooksydacji a grupami aminowymi białek. Ten proces jest najbardziej związany z warunkami hiperglikemicznymi, takimi jak cukrzyca, oraz starzeniem się. W przeciwieństwie do innych modyfikacji potranslacyjnych, glikacja nie ma określonej funkcji fizjologicznej. “Nasze analizy wskazują, że glikacja fibrinogenu prowadzi do istotnych zmian strukturalnych, które mogą promować stan prozakrzepowy” – podkreślają badacze.
Glikacja rozpoczyna się od tworzenia zasady Schiffa między cukrami redukującymi a grupami aminowymi białek, po czym następuje przegrupowanie Amadori do stabilnych produktów, które ostatecznie dają początek zaawansowanym produktom końcowym glikacji (AGEs), heterogennej i szkodliwej klasie związków. Podobnie, glikacja nukleofilowych grup innych długożyjących biomakromolekuł, takich jak aminofosfolipidy zewnętrznej warstwy błon komórkowych, prowadzi do zaawansowanych produktów końcowych lipoksydacji (ALEs).
AGEs i ALEs wywierają swoje szkodliwe działanie poprzez utratę funkcji białek docelowych, kowalencyjną modyfikację enzymów i receptorów, a także efekty immunogenne. Glikoliza generuje reaktywne dikarbonyle, takie jak metyloglioksal (MGO) i glioksal (GO), których reaktywności znacznie przekraczają glukozę (o 200-50 000 razy) pomimo ich niższych stężeń. MGO jest głównym czynnikiem stresu dikarbonylowego, który przejawia się jako stres oksydacyjny, zapalenie, starzenie i hiperglikemia. Dodatkowo, MGO jest obecny w prawie wszystkich pokarmach, a jego poziomy wzrastają podczas ogrzewania, fermentacji i przedłużonego przechowywania.
Glikacja jest przeciwdziałana przez systemy obronne: szlak glioksalazy detoksykuje MGO/GO, podczas gdy degradacja proteasomalna i autofagia usuwają strukturalnie uszkodzone glikowane białka.
Czy eksperymentalne badania ujawniają strukturę modyfikowanego fibrinogenu?
Badania in vitro konsekwentnie wykazały, że hiperglikemia prowadzi do strukturalnych i funkcjonalnych zmian w fibrinogenie, a stopień glikacji zależy od czasu inkubacji, temperatury i pH. Aby naśladować warunki hiperglikemiczne, fibrinogen inkubowano z D-rybozą, glukozą lub MGO. Badania badające zmiany morfologiczne w macierzach fibrynowych inkubowanych z glukozą przeprowadzono w celu uzyskania wglądu w mechanizmy leżące u podstaw stanu nadkrzepliwości związanego z hiperglikemią.
Jedno z badań wykazało, że glikowane struktury fibrynowe wykazują większą agregację i anizotropię niż ich nieglikowane odpowiedniki. Jednak przedłużenie okresu inkubacji z glukozą, symulujące fizjologiczne poziomy glukozy w osoczu, skutkowało strukturami skrzepu fibrynowego, które były mniej zagregowane i bardziej izotropowe niż te utworzone z nieinkubowanego fibrinogenu. Pomiar fraktalnego wymiaru skrzepu (df), który łączy wyższy df z gęstszą strukturą skrzepu fibrynowego, wykazał, że stężenie glukozy 10,0 mmol/L wytwarzało najgęstsze włókna w porównaniu ze stężeniem glukozy 6,0 mmol/L i 0,0 mmol/L.
Dodatkowo, zgłoszono, że glikacja fibrinogenu znacząco zmniejsza podatność skrzepu na degradację indukowaną plazminą. Co ciekawe, Svensson i wsp. zgłosili dwie glikowane lizyny (GlcK-133 w łańcuchu β i GlcK-75 w łańcuchu γ) w regionach “wrażliwych na plazminę” typu coiled-coil. Szczególnie interesujące jest to, że GlcK-133 znajduje się zaledwie dwa aminokwasy od znanego miejsca cięcia plazminy w K-130, co sugeruje, że glikacja w tej pozycji może zakłócać normalną fibrynolizę.
Methylglyoxal (MGO) jest szeroko stosowany do badania indukowanej hiperglikemią nieenzymatycznej glikacji białek. Glikacja fibrinogenu jest typowo osiągana przez inkubację ludzkiego fibrinogenu z ustalonymi lub zwiększonymi stężeniami MGO przez różne czasy inkubacji (od 0 do 14 dni) w temperaturze 37°C, aby naśladować warunki hiperglikemiczne obserwowane w cukrzycy.
MGO zmieniał trzeciorzędową i drugorzędową strukturę fibrinogenu. Chociaż glikacja głównie celuje w lizyny i argininy, histydyna i cysteina również mogą być dotknięte. Interakcja MGO-fibrinogen została scharakteryzowana za pomocą spektroskopii UV-Visible, ujawniając zależną od stężenia i czasu hiperchromowość w profilach absorbancji. Zmiany w widmach fluorescencji są szeroko stosowane do badania zakresu zmian w aromatycznych aminokwasach tyrozyny (Tyr), tryptofanu (Trp) i fenyloalaniny (Phe). Wyniki pokazują znaczące zmniejszenie wewnętrznych widm fluorescencji cząsteczek MGO-fibrinogenu w porównaniu do ich natywnych analogów.
Czy glikacja fibrinogenu zakłóca fibrynolizę w cukrzycy?
Analizy FTIR wykazały zauważalne przesunięcie pasma amidu I z 1642 do 1646 cm-1 w fibrinogenie modyfikowanym MGO, przypisywane rozciąganiu C=O i zmienionym interakcjom hydrofilowym, potencjalnie zakłócającym hydrofobowe regiony białka. Widma dalekiego UV CD wykazały wyraźne zmniejszenie eliptyczności, wskazujące na utratę natywnej zawartości α-helikalnej i wzrost struktury β-kartki, cech związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białka i agregacją. Łącznie, wyniki fluorescencji, FTIR i CD sugerowały, że glikacja wpływa na drugorzędową i trzeciorzędową strukturę fibrinogenu. Agregaty podobne do amyloidu zostały potwierdzone przez testy ThT i czerwieni Kongo, a typowa cecha obserwowana pod SEM i TEM silnie wspiera mikrostrukturę agregatów.
Cukrzyca charakteryzuje się przewlekłą hiperglikemią, która zwiększa ryzyko sercowo-naczyniowe. Zmiany w strukturze fibryny spowodowane glikacją fibrinogenu mogą przyczyniać się do tego ryzyka. Wykazano, że osoby z cukrzycą wykazują zmienione struktury sieci fibrynowej, a nieenzymatyczna glikacja fibrinogenu, napędzana podwyższonym poziomem glukozy we krwi, jest proponowana jako kluczowy mechanizm przyczyniający się.
Kilka badań badało wpływ glikacji fibrinogenu na strukturę fibryny poprzez analizę in vitro oczyszczonego fibrinogenu pacjentów z cukrzycą. Co ważne, pacjenci z cukrzycą poddawani leczeniu kontroli glikemicznej wykazują zmniejszenie glikacji fibrinogenu. Ponadto, wyższe poziomy fibrinogenu w osoczu stwierdzono u pacjentów z T2DM w porównaniu z grupą kontrolną, a hiperfibrinogenemia wydaje się być skorelowana z wartościami HbA1c. Co godne uwagi, glikowany fibrinogen wykazał potencjał jako uzupełniający marker do HbA1c do monitorowania kontroli glikemicznej.
Czy interwencje antyglikacyjne mogą poprawić funkcje skrzepu?
U osób z cukrzycą sieć fibrynowa i porowatość żelu fibrynowego są upośledzone, potencjalnie z powodu glikacji fibrinogenu, która zmienia zarówno właściwości strukturalne, jak i funkcjonalne. Li i wsp. zastosowali połączoną technikę mikroskopii sił atomowych/mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić właściwości mechaniczne poszczególnych włókien fibrynowych utworzonych z osocza diabetycznego. Ich odkrycia nie wykazały bezpośredniej korelacji między glikacją fibrinogenu a rozciągliwością włókna fibrynowego, modułem i relaksacją naprężeń, podczas gdy moduł włókna, Y, silnie zmniejsza się wraz ze zwiększającą się średnicą włókna, D. Silna zależność Y od D jest bardzo niezwykła i ma interesujące i znaczące konsekwencje dla właściwości całego skrzepu, a zwłaszcza dla wewnętrznej struktury i lateralnego montażu włókien fibrynowych.
Struktura skrzepu może być również oceniana przez mętność, przepuszczalność, mikroskopię konfokalną i SEM. Jedno badanie in vitro z użyciem oczyszczonego fibrinogenu stwierdziło, że skrzepy od osób z cukrzycą były gęstsze i mniej porowate niż te od osób kontrolnych. Z kolei inne badanie wykazało, że średnica włókna skrzepów od osób z cukrzycą i bez cukrzycy była podobna zarówno na początku, jak i po osiągnięciu kontroli glikemicznej, choć zauważono niewielki wzrost proporcji grubszych włókien w skrzepach diabetycznych po leczeniu.
Badania permeacji cieczy dalej ujawniły, że współczynnik przepuszczalności żelu fibrynowego (Ks) jest znacząco zmniejszony u pacjentów z cukrzycą, wskazując na ciaśniejszą i mniej przepuszczalną sieć fibrynową. Pomiary mętności zastosowano do oceny kinetyki polimeryzacji, w tym fazy opóźnienia, maksymalnego nachylenia (Vmax) i maksymalnej absorbancji (MaxAbs). Jednakże wyniki różnych badań były niejednoznaczne. Odnośnie czasu opóźnienia (czasu wymaganego dla włókien fibrynowych do wystarczającego wzrostu, aby umożliwić wykrycie absorbancji), jedno badanie nie wykazało różnicy między osobami z cukrzycą i bez cukrzycy, podczas gdy inne zgłosiło znacznie krótszy czas opóźnienia w skrzepach od pacjentów z cukrzycą.
Jakie wyzwania i perspektywy na przyszłość w ocenie modyfikacji fibrinogenu?
Sprzeczne wyniki zaobserwowano również dla Vmax, miary szybkości lateralnej agregacji. Pieters i wsp. zgłosili, że Vmax u osób z cukrzycą był znacząco wyższy i zmniejszył się po kontroli glikemicznej. Natomiast Luzak i wsp. zaobserwowali, że Vmax w skrzepach osocza T2DM był znacząco niższy niż u kontroli bez cukrzycy. Tę samą tendencję zaobserwowano w fibrinogenie traktowanym glukozą w porównaniu do białka kontrolnego.
Zmienione tworzenie sieci fibrynowej może przyczyniać się do zmniejszonej fibrynolizy. Wykazano, że diabetyczne skrzepy fibrynowe wykazują znacznie wolniejsze tempo lizy w porównaniu do tych od osób bez cukrzycy, którym towarzyszy zmniejszona generacja plazminy. Co godne uwagi, osiągnięcie kontroli glikemicznej i zmniejszenie poziomów glikacji fibrinogenu poprawia tempo lizy w modelu oczyszczonego fibrinogenu. Co ciekawe, Mirmiranpour i wsp. badali efekty suplementacji Lys w konwencjonalnym leczeniu T2DM. Ich wyniki wykazały, że Lys, jako inhibitor glikacji, może być skuteczny w redukcji nieenzymatycznej glikacji fibrinogenu i naprawie jego struktury i funkcji.
Modyfikacje strukturalne indukowane przez glikację mogą również prowadzić do tworzenia neoepitopów zdolnych do wywołania odpowiedzi immunologicznej. Glikowane białka wywołują silne i specyficzne odpowiedzi immunologiczne, prowadzące do produkcji przeciwciał. Alouffi i wsp. pokazują, że immunizacja królików cząsteczką fibrinogenu glikowaną D-rybozą znacząco regulowała w górę ekspresję mRNA TNF-α, IL-6, IL-1β i IFN-γ, wskazujące na odpowiedź zapalną. W konsekwencji autoprzeciwciała przeciwko glikowanemu fibrinogenowi zostały zaproponowane jako potencjalny biomarker we wczesnej diagnozie cukrzycy, ale także w związanych z nią wtórnych zaburzeniach.
Choroby sercowo-naczyniowe pozostają główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Poza tradycyjnymi czynnikami ryzyka, coraz większą uwagę kieruje się w stronę modyfikacji potranslacyjnych fibrinogenu, szczególnie glikozylacji i glikacji, które głęboko wpływają na właściwości skrzepu fibrynowego. Dowody wskazują, że modyfikacje węglowodanowe zmieniają polimeryzację fibryny, grubość włókna, gęstość skrzepu i podatność na lizę, przy czym glikozylacja ogólnie opóźnia polimeryzację i zmniejsza średnicę włókna, podczas gdy glikacja promuje agregację, przejścia z α-helisy do β-kartki i upośledzoną fibrynolizę.
Zmienione wzory glikozylacji zgłoszono w chorobach wątroby, migotaniu przedsionków, COVID-19, przewlekłym zakrzepowo-zatorowym nadciśnieniu płucnym, cukrzycy i schyłkowej niewydolności nerek, co sugeruje ich potencjał jako biomarkerów specyficznych dla chorób. Postępy, takie jak wysokoprzepustowe LC-MS, umożliwiły profilowanie specyficzne dla miejsca N-glikozylacji fibrinogenu, ujawniając powiązania z klinicznymi i biochemicznymi parametrami oraz wspierając jego rolę w stratyfikacji ryzyka sercowo-naczyniowego.
Modele eksperymentalne naśladujące hiperglikemię pokazują, że glikowany fibrinogen wytwarza gęstsze, mniej podatne na lizę skrzepy i może wyzwalać odpowiedzi immunologiczne prowadzące do tworzenia autoprzeciwciał, co rodzi możliwość, że przyczynia się do powikłań związanych z cukrzycą. Jednak utrzymują się główne ograniczenia metodologiczne: badania różnią się źródłem fibrinogenu i rodzajem oraz stężeniem czynników glikacyjnych (MGO lub glukozy), stosują heterogeniczne czasy inkubacji i brak standaryzacji testów. Zdefiniowanie warunków eksperymentalnych, które naprawdę naśladują stan diabetyczny, pozostaje kluczowym wyzwaniem. Ponadto, dane funkcjonalne dotyczące glikowanego fibrinogenu są nadal skąpe, podkreślając potrzebę bardziej rygorystycznych i systematycznych badań.
Podsumowanie
Modyfikacje fibrinogenu przez węglowodany, szczególnie glikozylacja i glikacja, odgrywają kluczową rolę w ocenie ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Glikozylacja jest procesem enzymatycznym, regulowanym i zintegrowanym z biosyntezą białek, podczas gdy glikacja zachodzi nieenzymatycznie, zwłaszcza w warunkach hiperglikemii. Badania wykazały, że zmiany w profilach glikozylacji fibrinogenu występują w różnych stanach chorobowych, w tym w chorobach wątroby, migotaniu przedsionków, cukrzycy i niewydolności nerek. Glikowany fibrinogen tworzy gęstsze skrzepy, które są trudniejsze do rozpuszczenia, co może przyczyniać się do powikłań naczyniowych. Postęp w technikach analitycznych, szczególnie w wysokoprzepustowej spektrometrii mas, umożliwił dokładniejsze profilowanie modyfikacji fibrinogenu. Mimo obiecujących wyników, wciąż istnieją wyzwania metodologiczne wymagające standaryzacji badań i lepszego zrozumienia funkcjonalnego znaczenia tych modyfikacji w kontekście klinicznym.
