Wpływ technik rozmrażania osocza na jakość krioprecypitatu

Czy homogeniczność osocza kluczem do precyzyjnych badań?

Badanie laboratoryjne przeprowadzone w akredytowanym przez AABB laboratorium produkcji składników krwi porównało wpływ różnych technik rozmrażania osocza na zawartość fibrynogenu i czynnika VIII w końcowym preparacie krioprecypitatu. Zastosowano model z parowanymi porównaniami technik rozmrażania osocza, co pozwoliło na wyeliminowanie zmienności międzydawców.

Badaniem objęto 30 par krioprecypitatów (pule po 5 jednostek) wytworzonych w trzech różnych eksperymentach z wykorzystaniem osocza wszystkich grup krwi ABO. Użyto 100 jednostek osocza pochodzącego z pobrań krwi pełnej w każdym z trzech eksperymentów. Dla eliminacji różnic między dawcami zastosowano innowacyjne podejście polegające na wstępnym łączeniu 10 jednostek osocza, dokładnym wymieszaniu, a następnie rozdzieleniu na identyczne homogenne jednostki przed zamrożeniem.

Czy różne techniki rozmrażania wpływają na parametry krioprecypitatu?

W badaniu porównano trzy pary technik rozmrażania: (1) łaźnia wodna 1-6°C vs 24-godzinne rozmrażanie w lodówce; (2) 24-godzinne vs 36-godzinne rozmrażanie w lodówce; (3) 24-godzinne vs 48-godzinne rozmrażanie w lodówce. Po rozmrożeniu osocza stosowano standardowe procedury produkcji krioprecypitatów, a następnie analizowano zawartość fibrynogenu i czynnika VIII w gotowych produktach.

Osocze wykorzystane w badaniu pochodziło głównie od dawców z dodatnimi przeciwciałami HLA, a do badania włączono wszystkie grupy krwi ABO i RhD. Po przygotowaniu homogenicznych pul osocza, próbki były zamrażane przy użyciu zamrażarki szokowej w temperaturze ≤–20°C. Badanie stężenia fibrynogenu przeprowadzono przy użyciu testu HemosIL fibrinogen-C, a aktywność czynnika VIII mierzono przy pomocy czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji z osoczem pozbawionym czynnika VIII w akredytowanym laboratorium referencyjnym.

Wyniki wykazały, że 24-godzinne rozmrażanie w lodówce prowadziło do znacząco wyższej zawartości fibrynogenu w krioprecypitacie w porównaniu z metodą łaźni wodnej (2554±375 mg vs 1824±225 mg, p<0,001). Jednocześnie zawartość czynnika VIII była istotnie niższa przy rozmrażaniu w lodówce (601±79 IU vs 709±101 IU, p<0,001). Wydłużenie czasu rozmrażania w lodówce do 36 godzin dodatkowo zwiększało zawartość fibrynogenu (3180±469 mg vs 2956±443 mg, p=0,03) przy jednoczesnym obniżeniu zawartości czynnika VIII (529±98 IU vs 573±88 IU, p=0,005). Podobnie, 48-godzinne rozmrażanie w lodówce dawało wyższą zawartość fibrynogenu niż 24-godzinne (2893±575 mg vs 2483±236 mg, p=0,01), przy niewielkiej i nieistotnej statystycznie różnicy w zawartości czynnika VIII.

Wszystkie badane metody rozmrażania pozwoliły uzyskać krioprecypitaty spełniające minimalne krajowe wymagania dotyczące zawartości czynnika VIII (400 IU) i podwójne minimalne wymagania dla fibrynogenu (1500 mg). Średni odzysk fibrynogenu z osocza wynosił: 40% przy metodzie łaźni wodnej, 54-63% przy 24-godzinnym rozmrażaniu w lodówce, 68% przy 36-godzinnym i 63% przy 48-godzinnym rozmrażaniu w lodówce. W przypadku czynnika VIII, odzysk wynosił odpowiednio: 53% dla łaźni wodnej, 41-45% dla 24-godzinnego rozmrażania w lodówce, 38% dla 36-godzinnego i 43% dla 48-godzinnego rozmrażania w lodówce.

Jakie są kliniczne implikacje optymalizacji krioprecypitatów?

Badanie ma szczególne znaczenie w kontekście zmiany głównego zastosowania klinicznego krioprecypitatów – z uzupełniania czynnika VIII (leczenie hemofilii A) na uzupełnianie fibrynogenu. Warto przypomnieć, że w połowie lat 60. XX wieku Pool i współpracownicy opracowali metodę produkcji krioprecypitatu jako skoncentrowanej formy czynnika VIII dla pacjentów z hemofilią A. Z czasem wykazano, że krioprecypitat zawiera również znaczne ilości czynnika von Willebranda, czynnika XIII i fibronektyny. Niedawno zatwierdzone przez FDA patogen-redukowane koncentraty fibrynogenu z krioprecypitatu są wskazane do leczenia krwawień związanych z niedoborem fibrynogenu, czynnika von Willebranda lub czynnika XIII, ale nie do leczenia niedoboru czynnika VIII.

Wyniki badania sugerują, że 24-godzinne rozmrażanie osocza w lodówce prowadzi do istotnie wyższej zawartości fibrynogenu i niższej zawartości czynnika VIII w krioprecypitacie w porównaniu z rozmrażaniem w łaźni wodnej. Wydłużenie czasu rozmrażania w lodówce do 36 lub 48 godzin może dodatkowo zwiększyć zawartość fibrynogenu. Obserwacje te mają praktyczne znaczenie dla optymalizacji procesu produkcji krioprecypitatów, szczególnie tych przeznaczonych do uzupełniania fibrynogenu, jak również przy wytwarzaniu patogen-redukowanych koncentratów fibrynogenu z krioprecypitatu.

Siłą tego badania jest zastosowanie wstępnie pulowanego osocza do tworzenia identycznych homogenicznych jednostek osocza do zamrażania i produkcji krioprecypitatu. Takie podejście eliminuje zmienność dawców pod względem zawartości fibrynogenu i czynnika VIII, co mogłoby zakłócać porównania zawartości krioprecypitatu, i umożliwia dokładniejsze porównania statystyczne. Główną słabością badania jest przeprowadzenie eksperymentów porównujących metody rozmrażania osocza parami, zamiast jednoczesnego porównania wszystkich 4 podejść do rozmrażania osocza, co wynikało z ograniczeń objętościowych dostępnych worków do wstępnego pulowania osocza.

Podsumowanie

Przeprowadzone w akredytowanym laboratorium badanie porównało wpływ różnych technik rozmrażania osocza na zawartość fibrynogenu i czynnika VIII w krioprecypitacie. Wykorzystano innowacyjną metodę wstępnego łączenia osocza w homogeniczne jednostki, eliminując zmienność między dawcami. Wykazano, że 24-godzinne rozmrażanie w lodówce skutkuje znacząco wyższą zawartością fibrynogenu (2554±375 mg) w porównaniu z metodą łaźni wodnej (1824±225 mg), przy jednoczesnym obniżeniu poziomu czynnika VIII. Wydłużenie czasu rozmrażania do 36 lub 48 godzin dodatkowo zwiększało zawartość fibrynogenu. Wszystkie badane metody spełniały minimalne wymagania dla zawartości obu składników. Wyniki mają istotne znaczenie dla optymalizacji produkcji krioprecypitatu, szczególnie w kontekście jego współczesnego zastosowania jako źródła fibrynogenu.